DNA Amplification Through Polymerase Chain Reaction

PCR står for polymerasekjedereaksjon, en molekylærbiologiteknikk for å amplifisere segmenter av DNA, ved å generere flere kopier ved bruk av DNA-polymeraseenzymer under kontrollerte betingelser. Så lite som en enkelt kopi av et DNA-segment eller et gen kan klones inn i millioner av kopier, slik at deteksjon kan brukes med fargestoffer og andre visualiseringsteknikker.

Utviklet i 1983 har prosessen med PCR gjort det mulig å utføre DNA-sekvensering og identifisere rekkefølgen av nukleotider i individuelle gener.

Metoden bruker termisk sykling eller gjentatt oppvarming og avkjøling av reaksjonen for DNA-smelting og replikasjon. Når PCR fortsetter, blir det "nye" DNA brukt som en mal for replikasjon og en kjedereaksjon følger, eksponentielt amplifiserer DNA-malen.

PCR-teknikker brukes på mange områder av bioteknologi, inkludert proteinteknikk, kloning, rettsmedisin (DNA fingeravtrykk), faderskapstesting, diagnose av arvelige og / eller smittsomme sykdommer, og for analyse av miljøprøver.

I rettsmedisin, spesielt PCR, er spesielt nyttig fordi det forsterker til og med den minste mengden DNA-bevis. PCR kan også brukes til å analysere DNA som er tusen år gammel, og disse teknikkene har blitt brukt til å identifisere alt fra en 800 000-årig mammut til mumier fra hele verden.

PCR-prosedyren er som følger:

• Initialisering: Dette trinnet er bare nødvendig for DNA-polymeraser som krever varmstart-PCR. Reaksjonen oppvarmes til mellom 94 og 96 ° C og holdes i 1-9 minutter.

• Denaturering: Hvis prosedyren ikke krever initialisering, er denaturering det første trinnet. Reaksjonen oppvarmes til 94-98 ° C i 20-30 sekunder. DNA-malens hydrogenbindinger forstyrres og enkeltstrengede DNA-molekyler opprettes.
• Annealing: Reaksjonstemperaturen er lavere til mellom 50 og 65 ° C og holdt i 20-40 sekunder. Primrene annealerer til den enkeltstrengede DNA-malen. Temperaturen er ekstremt viktig i løpet av dette trinnet. Hvis det er for varmt, kan ikke primeren binde seg. Hvis det er for kaldt, kan primeren binde ufullkommen. Et godt bånd dannes når primer-sekvensen nærmer seg mal-sekvensen.
• Forlengelse / forlengelse: Temperaturen under dette trinnet varierer avhengig av typen av polymerase. DNA-polymerasen syntetiserer en helt ny DNA-streng.
• Endelig forlengelse: Dette trinnet utføres ved 70-74 ° C i 5-15 minutter etter den endelige PCR-syklusen.
• Endelig hold: Dette trinnet er valgfritt. Temperaturen holdes ved 4-15 ° C og strekker reaksjonen.

Prosedyren er delt inn i tre faser:

• Eksponensiell forsterkning: I hver syklus blir produkt (det spesifikke stykket DNA som blir replisert) fordoblet.
• Leveling-off-scenen: Da DNA-polymerasen taper aktivitet og forbruker reagenser, vil reaksjonen bremse.
• Plateau: Ingen mer produkt akkumuleres.