Hvordan polymerase-kjedereaksjon virker for å forsterke gener

Polymerasekjereaksjonen (PCR) er en molekylærgenetisk teknikk for fremstilling av flere kopier av et gen og er også en del av gensekvenseringsprosessen.

Hvordan virker polymerase-kjedereaksjon?

Genkopier er laget ved hjelp av en prøve av DNA, og teknologien er god nok til å lage flere kopier fra en enkelt kopi av genet funnet i prøven. PCR-amplifisering av et gen for å lage millioner av kopier, muliggjør gjenkjenning og identifikasjon av gensekvenser ved bruk av visuelle teknikker basert på størrelse og ladning (+ eller -) av DNA-stykket.

Under kontrollerte forhold genereres små segmenter av DNA med enzymer som er kjent som DNA-polymeraser, som tilsetter deoxynukleotider (dNTP) til et stykke DNA kjent som "mal". Selv mindre DNA-deler, kalt "primere", brukes som utgangspunkt for polymerasen. Primers er små menneskeskapte biter av DNA (oligomerer), vanligvis mellom 15 og 30 nukleotider lange. De er laget ved å kjenne eller gjette korte DNA-sekvenser ved selve endene av genet som blir forsterket. Under PCR oppvarmes DNA'et som sekvenseres, og de dobbelte tråder separeres. Ved avkjøling binder primrene til malen (kalt annealing) og skaper et sted for polymerasen å begynne.

PCR-teknikken

Polymerasekjedereaksjonen (PCR) ble gjort mulig ved oppdagelsen av termofiler og termofile polymeraseenzymer (enzymer som opprettholder strukturell integritet og funksjonalitet etter oppvarming ved høye temperaturer).

Trinnene involvert i PCR-teknikken er som følger:

En blanding er opprettet, med optimaliserte konsentrasjoner av DNA-malen, polymeraseenzym, primere og dNTPer. Evnen til å oppvarme blandingen uten denaturering av enzymet tillater denaturering av den dobbelte helix av DNA-prøven ved temperaturer i området 94 grader Celsius.

• Etter denaturering blir prøven avkjølt til et mer moderat område, rundt 54 grader, hvilket letter primerens annealing (binding) til de enkeltstrengede DNA-malene.

I tredje trinn av syklusen blir prøven oppvarmet til 72 grader, den ideelle temperaturen for Taq DNA Polymerase, for forlengelse. Under forlengelse bruker DNA-polymerase den opprinnelige enkeltstrengen av DNA som en mal for å legge til komplementære dNTPer til 3'-enden av hver primer og generere en seksjon av dobbeltstrenget DNA i regionen av genet av interesse.

• Primers som har annealed til DNA-sekvenser som ikke er en nøyaktig kamp, ​​forblir ikke annealed ved 72 grader, og dermed begrenser forlengelse til genet av interesse.
• Denne prosessen med denaturering, glødning og forlengelse gjentas flere (30-40) ganger, hvorved eksponentielt øker antall kopier av det ønskede gen i blandingen.Selv om denne prosessen ville være ganske kjedelig hvis den ble utført manuelt, kan prøver fremstilles og inkuberes i en programmerbar termocykler, nå vanlig i de fleste molekylære laboratorier, og en komplett PCR-reaksjon kan utføres på 3-4 timer.
• Hvert denatureringstrinn stopper forlengelsesprosessen av den forrige syklusen, og dermed trunkerer den nye DNA-strengen og holder den til omtrent størrelsen på det ønskede gen.

Lengden på forlengelsesyklusen kan gjøres lengre eller kortere avhengig av størrelsen på genet av interesse, men til slutt, gjennom gjentatte sykluser av PCR, vil hovedparten av maler begrenses til størrelsen av det gen av interesse alene , da de vil bli generert fra produkter av begge primere.

Det finnes flere forskjellige faktorer for vellykket PCR som kan manipuleres for å forbedre resultatene. Den mest brukte metoden for å teste for tilstedeværelsen av PCR-produktet er agarosegelelektroforese. Som brukes til å separere DNA-fragmenter basert på størrelse og ladning. Fragmentene blir deretter visualisert ved å bruke farger eller radioisotoper.

Evolusjonen

Siden oppdagelsen av PCR har andre DNA-polymeraser enn den opprinnelige Taq blitt oppdaget. Noen av disse har bedre "korrekturlesende" evne eller er mer stabile ved høyere temperaturer, og dermed forbedrer spesifisiteten til PCR og reduserer feil fra innsetting av feil dNTP.

Noen variasjoner av PCR er utviklet for spesifikke applikasjoner og brukes nå regelmessig i molekylære genetiske laboratorier. Noen av disse er realtids-PCR og revers-transkriptase-PCR. Oppdagelsen av PCR har også ført til utvikling av DNA-sekvensering, DNA fingeravtrykk og andre molekylære teknikker.