Teknikker for sekvensering DNA

Bioteknologi er en av konstant forandring. Den raske veksten og utviklingen av banebrytende forskning er avhengig av forskernes innovasjon og kreativitet og deres evne til å se potensialet i en grunnleggende molekylærteknikk og anvende den på nye prosesser. Tilkomsten av PCR åpnet mange dører i genetisk forskning, inkludert et middel til DNA analyse og identifisering av forskjellige gener basert på deres DNA-sekvenser.

DNA-sekvensering er også avhengig av vår evne til å bruke gelelektroforese til å separere DNA-strengene som varierer i størrelse med så lite som ett basepar.

DNA-sekvensering

I slutten av 1970-tallet ble to DNA-sekvenseringsteknikker for lengre DNA-molekyler oppfunnet. Disse var

Sanger (eller dideoxy) metoden og Maxam-Gilbert (kjemisk spaltning) metode. Maxam-Gilbert-metoden er basert på nukleotidspesifikke spaltning av kjemikalier og er best brukt til å sekvensere oligonukleotider (korte nukleotidpolymerer, vanligvis mindre enn 50 basepar i lengde). Sanger-metoden er vanligere brukt fordi det har vist seg å være teknisk lettere å anvende, og med advent av PCR og automatisering av teknikken, blir det lett brukt på lange DNA-tråder, inkludert noen hele gener. Denne teknikken er basert på kjedeavslutning av dideoxynukleotider under PCR-forlengelsesreaksjoner.

Sanger Metode

I Sanger-metoden blir DNA-strengen som skal analyseres, brukt som en mal, og DNA-polymerase brukes i en PCR-reaksjon for å generere gratis tråder ved bruk av primere.

Fire forskjellige PCR-reaksjonsblandinger fremstilles, hver inneholdende en viss prosentdel av dideoxynukleosidtrifosfat (ddNTP) -analoger til en av de fire nukleotidene (ATP, CTP, GTP eller TTP). Syntese av den nye DNA-strengen fortsetter til en av disse analogene er innarbeidet, på hvilket tidspunkt strengen for tidlig avkortes.

Hver PCR-reaksjon vil ende opp med å inneholde en blanding av forskjellige lengder av DNA-tråder, alt som slutter med nukleotidet som var dideoxy-merket for den reaksjonen. Gelelektroforese brukes så til å separere strengene av de fire reaksjonene, i fire separate baner, og bestemme sekvensen av den opprinnelige mal basert på hvilke lengder av tråder som slutter med hvilket nukleotid.

I den automatiserte Sanger-reaksjonen brukes primere som er merket med fire forskjellige fargede fluorescerende merker. PCR-reaksjoner, i nærvær av de forskjellige dideoxy-nukleotider, utføres som beskrevet ovenfor. Imidlertid blir de fire reaksjonsblandingene deretter kombinert og påført på en enkelt lane av en gel. Fargen på hvert fragment blir detektert ved hjelp av en laserstråle og informasjonen samles inn av en datamaskin som genererer kromatogrammer som viser topper for hver farge, hvorfra DNA-DNA-sekvensen kan bestemmes.

Typisk er den automatiserte sekvenseringsmetoden bare nøyaktig for sekvenser opp til maksimalt 700-800 basepar i lengde. Imidlertid er det mulig å oppnå full sekvenser av større gener og faktisk hele genomer, ved hjelp av trinnvise metoder som Primer Walking og Shotgun-sekvensering.

I

Primer Walking sekvenseres en brukbar del av et større gen ved å bruke Sanger-metoden. Nye primere genereres fra et pålitelig segment av sekvensen og brukes til å fortsette sekvensering av delen av genet som var utenfor rekkevidden av de opprinnelige reaksjonene. Shotgun-sekvensering

medfører tilfeldig kutting av DNA-segmentet av interesse i mer hensiktsmessige (håndterbare) størrelsesfragmenter, sekvensering av hvert fragment og arrangering av bitene basert på overlappende sekvenser. Denne teknikken har blitt lettere ved anvendelse av dataprogramvare for å arrangere de overlappende stykkene.